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科学研究

编辑:系统管理员 发布日期:2013-10-09 来源:新闻宣传中心

围绕医药蛋白的研发,团队目前正在开展以下科学研究:

1)高通量微生物菌种筛选和评价技术平台的建立

建立基于24-96微孔板(Micro-titer plate, MTP)的高通量、半自动的微生物菌种筛选和评价技术平台。该技术平台包括以下几个方面的研究:

① 设计高氧传递系数(Kla)的24/96微孔板培养板和液体混合动力学研究;

② 设计高气体交换率和低液体挥发率的培养板盖;

③ 多通道自动液体移动装置的设计;

④ 细菌和酵母菌在MTP中高通量培养策略的研究;

⑤ 在MTP中高密度细胞培养技术的研究;

⑥ 高通量样品分析技术的建立与评价;

⑦ 平行发酵培养技术和设备的研究(硬件与软件);

⑧ 基于MTP培养体系的对重组蛋白表达培养过程的Scale-down/scale-up 模型(模式);

2)人源化治疗性抗体片段(dAb)在E.coli宿主细胞内可溶性高效表达水平与抗体氨基酸性质和构成的关联

人们对蛋白质在大肠杆菌中表达水平的影响因素研究多集中在表达的生物过程方面,却忽略了外源蛋白本身的AA序列和构成对最终表达水平的影响,相关研究的欠缺使得在抗体片段创新药物的研发中不得不采用高通量菌种培养技术,尝试大量的表达载体组合来筛选最适合的大肠杆菌表达体系,成功率很低。Domain antibody(dAb)是最小的抗体分子,其保守区AA比例高,替换可变区内某些AA仍能保持其与抗原结合的能力,在前期工作中我们发现仅改变其CDR区或在N端增加极少AA就会导致表达量产生巨大变化。应用已建立的高通量培养和蛋白分析技术平台对系列dAb分子在大肠杆菌内表达情况进行定量研究,应用多变元分析技术建立AA序列和构成与表达水平之间关系的模型,期望发现其中具有统计意义上的科学规律,并阐述该规律的分子生物学原理,建立普适性的大肠杆菌高效可溶性表达策略,所获成果有很高的实际应用价值和重要的科学意义。

3)表达外源蛋白细菌培养过程中细胞自溶与过程参数胁迫的定量关联性研究

表达外源蛋白细菌培养过程中的细胞自溶现象是一个普遍性的过程工程问题。人们已认识到生长环境胁迫可以诱导σE信号传导途径启动细菌细胞自溶,但是发生在生物反应器内的环境胁迫事件(过程参数)、外源蛋白本身对宿主细胞的额外代谢负荷与σE介导的细胞自溶途径的定量关联,尚未见研究报道。使用表达全人源dAb抗体的E. coli细胞培养过程为模型,应用平行发酵培养技术和多变元数据分析手段,分别在培养过程中施加预定的过程参数胁迫事件,测量与细胞自溶相关的参数及σE自溶途径相关因子的变化,研究细胞自溶发生时机及程度与过程参数胁迫和外源蛋白氨基酸组成的定量关联性及其细菌自溶的分子机理,为解决细菌培养过程中细胞自溶的控制问题提供基础理论依据,用于指导基于细菌宿主细胞的外源蛋白表达过程设计,为生物医药研发中候选活性蛋白的分子设计提供过程工程参考依据。

4)微生物过程PAT技术的应用与微生物细胞反应器内细胞‘过程动态’生理学研究。

使用平行微生物培养系统,对本团队所建立的创新细菌外源蛋白质表达体系在生物反应器内的表现特征(performance) 开展研究,计划回答以下几个科学问题:

①通过使用PAT技术, 探索反应器内培养条件对重组蛋白表达水平、表达质量和胞外可溶性外源蛋白分泌水平的影响,同时建立过程的批式(batch level)多变元数学模型,实现过程模型预测产品质量的模式;

② 应用高通量检测技术和多变元数学分析方法,对反应器内培养过程中菌体细胞蛋白特征(protein profile)的动态变化进行定量分析,以发现在不同培养阶段和培养条件下,菌体蛋白特征与:1)外源目标蛋白表达水平、表达质量和分泌水平的生物相关性,2)重要反应器内培养过程参数的因果相关性,进而确定与特定细胞代谢途径相关的关键蛋白质(组),然后使用蛋白组学的技术手段确定这些蛋白质在细胞代谢中的作用和调控机理。这些基础数据将用于对本研究所建立的表达体系进行优化改进,同时用于指导培养过程的工艺优化研究;

③ 通过高通量的平行培养和高通量蛋白分析研究发现重组蛋白宿主细胞在分子水平上的抗逆机理。该结果可用于提高微生物培养过程稳定性的培养方案设计、菌种改进和过程优化。

开展此方向研究所涉及的平台技术:

①高通量微生物培养系统 – 德国Dasgip 平行发酵系统

②高通量蛋白质分析系统 – 美国Caliper 公司微流体蛋白分析系统

③多变元数据分析软件– 瑞典UMETRICS 公司Simca + 系统, 等。

5)构建具有自主知识产权的细菌重组蛋白表达体

本研究所选择的细菌菌种初步设想为Pseudomonas, Bacillus subtilis, 或Corynebacterium glutamicum 等在传统食品、工业酶和氨基酸发酵中广泛应用细菌。这种创新的重组蛋白表达体系要具有以下优点:

① 可溶性表达外源蛋白,并分泌到胞外;

② 正确地形成二硫键;

③ 宿主细胞较少分泌宿主蛋白;

④ 宿主细胞无蛋白酶降解目标蛋白;

⑤ 宿主细胞有较低的内毒素产生;

⑥ 宿主细胞可在简单的培养基中进行高细胞密度培养;

⑦ 细胞代谢调控简单;

⑧ 细胞具有很好的抗逆能力;

⑨ 拥有适应不同目标蛋白的表达的plasmids, leader sequence, promoters 等组件。

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