适应性进化降低黄酒酵母尿素积累的研究

黄酒一种具有悠久历史的酒精饮料，由于黄酒所具有的独特的风味和较高的营养价值，受广大消费者的欢迎。然而，在黄酒中也存在一些有害成份，如氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)。EC是一类广泛存在于发酵食品中的2A类潜在致癌物质，主要由尿素和乙醇自发反应生成。尿素作为黄酒发酵主效菌株——酿酒酵母的非偏好型氮源，在发酵过程中利用滞后，导致在发酵体系中大量积累。因此如何提高黄酒酵母对尿素的利用率，是降低黄酒产品中EC含量的关键问题。

本研究通过适应性进化，将黄酒酵母XZ-11在尿素为唯一氮源的培养条件下不断传代培养提高菌株尿素利用效率。通过建立基于流式细胞术的超高通量筛选技术，对经过360次传代后的适应性进化菌进行初筛。在所检测的4721株进化菌中，筛选到3株尿素利用率显著提高的适应性进化菌株：10G、7H和4B，相对于出发菌XZ-11菌株，发酵后期尿素的积累量分别降低了37.4%、39.9%和43.9%。以三株进化菌进行黄酒模拟黄酒发酵结果显示，相对于出发菌株，在黄酒发酵体系中，10G、7H和4B菌株在发酵体系中尿素的积累量分别降低了12.4%、16.6%和47.9%，而EC的含量分别降低了18.6%、28.7%和40.5%。

对出发菌XZ-11和三株适应性进化菌进行比较基因组学分析发现，与氮源代谢相关的基因ATT2(参与α-酮戊二酸向谷氨酸的转化)、PRO1(参与谷氨酸向鸟氨酸的转化，最终进入尿素循环)和ARG2(与谷氨酸代谢生成鸟氨酸相关)在尿素为唯一氮源传代过程中快速进化，可能是进化菌尿素利用效率提高的原因之一。另外在三株进化菌基因组的12号染色体上，同时存在大片段(约38.5 kb)的多拷贝变异，涉及到22个基因。其中包括编码异柠檬酸脱氢酶的基因IDP2，其负责将草酰乙酸转化为α-酮戊二酸。以上结果表明，在黄酒酵母氮源利用过程中，碳源代谢对氮源利用也具有重要影响。对尿素代谢和调控途径相关基因进行定量PCR检测发现，在进化菌4B中，直接参与尿素代谢的基因，如DUR1,2、DUR3和CAR1，转录水平比在出发菌中都有显著提高，分别提高了81.2、8.1和24.8倍。而与尿素代谢调控相关的转录激活因子GLN3和GAT1比转录阻遏因子GZF3、DAL80和URE2表达的上调倍数更高。另外比较不同进化菌株间相关基因表达情况发现，尿素代谢相关基因表达上调程度与菌株尿素利用率存在正相关性。

本研究通过适应性进化结合高通量筛选技术筛选到尿素利用率显著提高的黄酒酵母进化菌株。相较以往通过代谢工程改造等手段降低黄酒发酵中尿素积累等手段，适应性进化避免了基因操作，不会给消费者带来转基因安全性方面的顾虑。此外，本研究中所建立的基于流式细胞术的高通量分选技术，相比于传统筛选方法，极大的降低了人力和时间成本，大幅提高了筛选效率，适用于其他育种研究。

本文以“Adaptive Evolution Relieves Nitrogen Catabolite Repression and Decreases Urea Accumulation in Cultures of the Chinese Rice Wine Yeast StrainSaccharomyces cerevisiaeXZ-11”为题发表于“Journal of Agricultural and Food Chemistry”期刊，国工张伟平为第一作者，周景文教授和陈坚院士为通讯作者。这一研究受到了国家重点研究和开发项目(No. 2017YFC1600403)、国家自然科学基金(No. 31670095, 31770097, 31671836)和江苏省重点研究和开发项目(No. BE2016689)项目支持。

图1进化过程中尿素积累量降低百分比

每60次传代后检测体系中尿素含量，与出发菌相比得到降低百分比。正方形、圆形和三角形符号分别表示在0.03、0.3和1.5 g/L尿素浓度的培养体系中进化结果。

图2进化菌发酵性能检测

(a) 4721株进化菌初筛结果；(b) 9株低积累尿素进化菌的复筛结果；(c, d)适应性进化菌10G、7H和4B及出发菌XZ-11的生长和尿素利用情况；(e, f, g)发酵终点体系中尿素、乙醇和EC含量。

图3适应性菌株基因组多拷贝变异

图4尿素代谢和调控途径

图5进化菌株中与尿素代谢和调控相关基因的转录情况

黑色、深灰和浅灰色分别表示7H、4B和10G菌株中相关基因的表达情况

图6期刊封面